来源： 食品科学杂志 发布时间：2024年01月18日
酵母菌对葡萄酒品质和风格起着重要作用。在葡萄酒酿造中，用单一商业酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌剂进行发酵使葡萄酒质量风味趋近，产品风格特色不突出。研究已经证实，在葡萄酒酒精发酵（AF）前期，一些非酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的菌种参与发酵会增加葡萄酒感官特征的复杂性。毕赤酵母（Pichia）是葡萄酒自然发酵过程中普遍存在的酵母菌种，也是重要的产酯酵母之一，对葡萄酒香气成分的多样性做出了重要贡献。季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）由于其独特的代谢活动，在各种代谢产物的合成、功能蛋白的生产和生物防治方面表现出了巨大潜力；M. guilliermondii与一些化学物质结合可以提高对霉菌的抑制作用。
目前关于非S. cerevisiae与S. cerevisiae混菌发酵的研究大部分是在实验室微酿条件下的结果，中试规模下的应用研究鲜有报道，而中试实验是将实验室成果与产业化应用连接的重要桥梁。因此，甘肃农业大学食品科学与工程学院的藏伟、王婧*和甘肃紫轩酒业有限公司的刘叶等人将NM218与商业S. cerevisiae以顺序接种的模式进行中试发酵，并对发酵过程中酵母生长状况、葡萄酒酿酒学特性和感官特征进行分析，以期明晰M. guilliermondii的应用潜力，为M. guilliermondii的工业化应用提供一定数据参考。
1 AF过程中的相对密度变化
采取比重法对发酵进程进行监测，发酵温度控制在25～27 ℃左右，发酵进程见图1，对照组在发酵第1～6天时相对密度下降最快，说明这一阶段发酵速率较高；第7天相对密度下降趋势减缓，发酵速率开始减缓，直至第18天发酵结束。处理组在1～7 d发酵速度较快，随后发酵减缓，与对照组相比，发酵时间延长了2～3 d。
2 发酵过程酵母生物量分析
由表2可知，对照组中S. cerevisiae在整个AF过程中生物量呈现先上升后下降的趋势，在发酵中期以前始终保持107 CFU/mL数量级。处理组中，S. cerevisiae、M. guilliermondii生物量同样呈现出先上升后下降的趋势，其中，M. guilliermondii生物量在接种48 h后达到最大（8×107 CFU/mL），至发酵中期时，S. cerevisiae的生物量（107 CFU/mL）已远大于M. guilliermondii（105 CFU/mL），发酵末期未检测到M. g u i l l i e r m o n d i i 的存在，而S. cerevisiae的生物量保持在105 CFU/mL水平。
3 常规理化指标分析
由表3可知，供试酒样基本理化指标均符合GB/T 15037—2006《葡萄酒》的要求。两款酒样残糖质量浓度均低于4 g/L，表明酒样均能彻底发酵；乙醇体积分数范围为13.95%～14.44%，处理组乙醇含量显著低于对照组，说明M. guilliermondii的参与能够降低乙醇体积分数；酒样中挥发酸质量浓度均不高于0.78 g/L，说明酒样发酵过程无异常情况；AF-NM与5M-NM处理组酒样总酸含量均低于对照组酒样，但差异不显著，随着陈酿的进行，5M-CK与5M-NM酒样总酸含量均显著降低；AF-NM与5M-NM处理组酒样甘油含量均显著低于对照酒样，说明M. guilliermondii并不是高产甘油的非S. cerevisiae。
4 颜色指标分析
由表4可以看出，基于CIELab颜色空间的5 个参数数据结果均表现为处理组酒样显著高于同一时期对照组酒样。L*代表酒样的明暗程度，L*越大，酒样颜色越亮。AF结束时，AF-NM酒样的L*值显著高于AF-CK酒样211.47%，陈酿5 个月后依然高于对照酒样180.80%；虽然陈酿5 个月后各酒样L*值均呈上升趋势，但5M-CK酒样比AF-CK的L*值仅增高了24.33%，而5M-NM酒样比AF-NM的L*值增高了37.91%，说明菌株NM218的参与发酵对颜色明亮度影响显著。a*值代表酒样红绿色程度，a*值越高说明酒体颜色中红色分量越大，可以看出，AF结束时和陈酿5 个月后，处理组酒样比同一时期对照酒样的a*值分别增加了42.35%、47.01%，说明菌株NM218参与发酵可能能够增强某种红色成分的物质。b*值代表酒样黄蓝色程度，b*值越高说明酒体颜色中黄色分量越大，通常干红葡萄酒陈酿时间越长，b*值也逐渐增高，而本实验中，AF结束时和陈酿5 个月后，处理组酒样比同一时期对照酒样的b*值分别增加了174.53%、205.68%，说明菌株NM218在AF过程即显著增加了酒体黄色成分的分量。由此也相应地使处理组酒样的C*ab值（色彩饱和度）和h*ab（色调）增高。色差（ΔE*ab）与L*、a*和b*值贡献程度有关，表征酒样间总体差异程度。以AF-CK为参比酒样，5M-CK表现为ΔE*ab大于4，AF-NM与5M-NM均表现为ΔE*ab大于22，说明菌株NM218参与发酵对色差影响显著。AF结束时，处理组AF-NM总花色苷含量和单体花色苷比例显著低于对照（AFCK）酒样，尤其总花色苷含量降低了49.08%。陈酿5 个月后，各酒样总花色苷含量也都略有下降，在5 个月的陈酿过程中，5M-NM较AF-NM降低了1.80%，这个降低幅度与对照酒样即5M-CK较AF-CK的降低幅度差异不大，说明菌株NM218在AF过程中能够显著降低花色苷含量。离子化指数反映葡萄酒中对颜色起贡献的花色苷比例，从表4可以看出，处理组酒样的离子化指数均显著高于同一时期对照酒样，数据结果与L*值、b*值相对应，说明菌株NM218显著增加了酒中对颜色起贡献的花色苷比例。
5 香气化合物分析
实验通过HS-SPME-GC-MS法分析酒样香气物质，共检测出64 种挥发性香气化合物，包括醇类18 种、酯类31 种、萜烯类7 种、酸类2 种、醛酮及其他类6 种，各个酒样的挥发性化合物种类及含量均有差异（图2、表5）。
高级醇类物质是酵母氨基酸代谢的次级产物之一，是葡萄酒中的主要香气物质，高级醇低于300 mg/L时可以增加葡萄酒香气的复杂性，赋予葡萄酒怡人的花香和水果香，但当高于400 mg/L时会给葡萄酒带来刺鼻的气味。适量的醇类物质可使葡萄酒的香气更为复杂、浓郁，如2,3-丁二醇具有橡胶、奶油、水果味；正辛醇赋予葡萄酒茉莉、柠檬、柑橘等多种风味。这些醇类物质对葡萄酒整体感官质量有一定的优化作用。两款酒样共检测出18 种醇类物质，总质量浓度为16 444.37（AF-NM）～23 056.98 μg/L（5M-CK），均低于3 0 0 m g/L。异戊醇（＞4 7.4 7%）和2-苯乙醇（＞47.39%）在醇类物质中占比最大，OAV均大于1，赋予葡萄酒香蕉、蜂蜜、玫瑰、丁香花等气味。
酯类物质是葡萄酒香气中的重要组成部分，主要在葡萄酒发酵和陈酿过程中产生，可以赋予葡萄酒愉悦的花香和果香，对葡萄酒香气的形成起着至关重要的作用。两款酒样共检测出31 种酯类物质，酯类物质的总质量浓度为11 244.49（AF-CK）～15 224.347 μg/L（5M-NM）。辛酸乙酯在酯类物质中占比最大，其次为丁二酸二乙酯、己酸乙酯和癸酸乙酯等。AF-NM酒样中，丁酸乙酯（97%）、乙酸异戊酯（123%）、己酸乙酯（59%）、庚酸乙酯（621%）、辛酸甲酯（43%）、辛酸乙酯（37%）、己酸异戊酯（77%）、反-4-癸烯酸乙酯（238%）、乙酸苯乙酯（61%）和3-苯丙酸乙酯（140%）含量均显著高于AF-CK。5M-NM中辛酸乙酯（35.45%）、乙酸异戊酯（10%）、庚酸乙酯（151%）、丁二酸二乙酯（63%）、反-4-癸烯酸乙酯（351%）和肉豆蔻酸乙酯（83%）含量均高于5M-CK。值得注意的是，丁酸异戊酯和辛酸异戊酯仅在处理组中检出。
脂肪酸是酵母在脂肪酸代谢过程中形成的，当接近其阈值时，葡萄酒会产生果味、奶酪味、黄油味。但浓度过高会使葡萄酒具有“汗味”、“脂肪味”、“腐臭味”等不良风味。实验共检测出正己酸、辛酸两种脂肪酸，其中，对照组与处理组酒样经陈酿后总酸均显著高于AF结束的酒样。值得注意的是，辛酸只在对照组中检出。
萜烯类物质阈值较低，赋予葡萄酒浓郁的香气。实验共检测出芳樟醇、香茅醇、橙花醇、反式-橙花叔醇、大马士酮、香叶基丙酮、α-萜品醇7 种萜烯类物质。其中，5M-CK较AF-CK、5M-NM较AF-NM大马士酮含量显著增加，分别增加了120%、171.43%。处理组与对照组在同一时期萜烯类物质总含量没有显著性差异，但经陈酿后分别增加了170.14%、115.01%。还检测到6 种酮醛及其他类化合物，总质量浓度为290.83～577.48 μg/L，包括醇酮类5 种、其他类化合物1 种，尽管这些物质含量较低，但对酒体香气复杂性有一定的积极贡献。
6 主要香气化合物的热图分析
OAV为香气物质的含量与气味阈值的比值，是评价单一香气化合物对葡萄酒整体香气贡献程度的指标。为确定供试酒样的香气差异，对OAV＞0.1的香气物质进行热图聚类分析。由图3可知，AF-CK酒样中芳樟醇、月桂酸乙酯、辛酸甲酯、1-壬醇等含量较高，赋予葡萄酒浓郁的菠萝、梨、柑橘等香气；AF-NM酒样中月桂酸乙酯、乙酸苯乙酯、辛酸甲酯、己酸乙酯等香气物质含量较高，赋予葡萄酒复杂浓郁的香蕉、草莓、苹果、柑橘等水果香；5M-CK酒样中大马士酮、壬醛、3-甲基丁酸乙酯、2-苯乙醇、癸酸乙酯等香气物质含量较高，能够为葡萄酒带来复杂浓郁的玫瑰、橙子、黑莓、香蕉、丁香花等气味；5M-NM酒样中大马士酮、乙酸苯乙酯、香茅醇、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、正辛醇等香气物质含量较高，能够为葡萄酒带来浓郁的玫瑰、青柠檬、苹果等香气。热图分析表明，NM-218与S.cerevisiae 顺序接种发酵能够增加部分酯类、萜烯类物质的含量，提升赤霞珠干红葡萄酒中的花香、果香，提高香气复杂性。
7 感官分析
为更好地评估供试菌株对葡萄酒感官质量的影响，进行感官评价（图4）。外观方面，处理组酒样与对照组酒样在AF结束、陈酿5 个月均呈紫红色，但处理组酒样较同一时期对照组酒样紫红色较浅；香气方面，AF结束与陈酿5 个月酒样均无明显异味，处理组酒样花香、果香显著优于对照组；口感方面，处理组酒样AF结束时酸度较低、余味较强，经陈酿后处理组余味、酸甜平衡感较强；处理组酒样在陈酿5 个月后整体评分方面也获得了较高的分数，酒样酒体协调、香气浓郁。
8 讨 论
近年来，消费市场对不同类型和风格葡萄酒的需求不断增长，而S. cerevisiae与本土非S. cerevisiae混合发酵作为一种调控葡萄酒香气特性的新工艺，成为了研究和应用的热点之一。NM218菌株是本实验室优选出的1 株本土菌株，前期研究表明，菌株NM218能够在350 g/L葡萄糖、250 mg/L SO2、pH 2.5和9%乙醇条件下表现出较好的耐受性，在反应温度40 ℃、pH 4.0条件下，β-葡萄糖苷酶活力可达49.5 mU/mL，具有应用于混菌发酵的潜力。因此，为保证实验中NM218在葡萄酒发酵过程具有较高的生物量与β-葡萄糖苷酶活力，NM218以48 h后接种S. cerevisiae的接种策略进行混菌发酵。
色泽是评价葡萄酒风味质量的重要指标，而花色苷是其颜色的物质基础，对红葡萄酒颜色起决定作用。本研究中，处理组AF-NM酒样总花色苷质量浓度（291.08 mg/L）显著低于对照组AF-CK酒样（571.67 mg/L），这可能归因于M. guilliermondii NM218高β-葡萄糖苷酶活力。然而，AF-NM酒样的a*值（45.61）却高于AF-CK（32.04），AF-NM酒样离子化指数与AF-CK酒样相比显著增高，说明处理组酒样对颜色起贡献的花色苷比例较高，所以处理组a*值高于对照组的原因可能是M. guilliermondii能够使酒样中产生对红色分量贡献较大的花色苷类物质，从而导致a*值较高，具体原因尚不清楚，这一点后期还需继续研究以明确酒样中不同成分对颜色的影响。本研究AF-NM酒样b*值（24.90）显著高于AF-CK（9.07），陈酿5 个月后趋势不变。这一结果可能与吡喃类花色苷的含量有关，从颜色参数可以看出，处理组酒样陈酿5 个月的花色苷总量低于对照组，红色指标和黄色都明显增加，这一结果还需继续在陈酿期进行跟踪检测以探明原因。同时也说明，针对高β-葡萄糖苷酶活力的M. guilliermondii菌种在干红葡萄酒的应用中，可以考虑适当延长浸渍时间，让花色苷等呈色物质更好的浸入葡萄酒；其次，也可以考虑针对桃红葡萄酒或干白葡萄酒的酿造进行应用研究。
香气是葡萄酒感官评价的重要指标，也是影响葡萄酒感官质量的重要因素。研究表明，毕赤酵母属与S. cerevisiae混合发酵可以有效提高冰酒的香气复杂性和丰富度，可酿造出具有本土特色的优质葡萄酒。本研究中，NM218与S. cerevisiae顺序接种发酵能够增加乙酸异戊酯、辛酸异戊酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、香茅醇等部分酯类、萜烯类物质的含量，提升赤霞珠干红葡萄酒中的花香、果香，提高香气复杂性。值得注意的是，丁酸异戊酯与辛酸异戊酯仅在处理组中检出，这可能与NM218菌株的某种酿酒特性有关，具体机制还有待进一步研究。
9 结 论
本土M. guilliermondii菌株NM218与商业S. cerevisiae FX10以间隔48 h顺序接种进行赤霞珠干红葡萄酒中试酿造，在AF过程中，M. guilliermondii细胞活菌数在AF中期逐渐降低为105 CFU/mL，到发酵末期完全消亡，而S. cerevisiae自接种后到发酵末期一直存在于发酵体系；所得酒样基本理化指标均符合GB/T 15037—2006的要求；顺序接种能提高酒体CIELab颜色参数、离子化指数，降低总花色苷含量与单体花色苷比例，使酒样颜色亮度、红色色调、黄色色调与色彩饱和性与对照酒样存在显著差异；此外，顺序接种发酵能够增加酒样中丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸甲酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、香茅醇等酯类、萜烯类物质的含量，且有2 种独有香气，赋予赤霞珠干红葡萄酒浓郁的花香、果香，提高香气复杂性，在一定程度可以提升葡萄酒的感官品质。综上结果表明，NM218与FX10顺序接种发酵可以增强干红葡萄酒香气品质和感官愉悦感。
本文《本土季也蒙毕赤酵母在干红葡萄酒中试生产中的应用潜力》来源于《食品科学》2023年44卷18期117-125页. 作者：藏伟，刘叶，刘宇，彭帅，陈学莲，王婧. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220907-069. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
（来源：食品科学杂志）
（编辑：小剑）
